UNIDADE 1: Técnicas assépticas e semeadura de bactérias em meios de cultura
OBJETIVOS: Ao final da pratica o aluno deverá ser capaz de:
Executar e entender o fundamento das principais técnicas assépticas na pratica de bacteriologia incluindo:
Manobras na zona de segurança ao redor do bico de Bunsen;
Esterilização (flambagem) de alças e agulhas bacteriológicas;
Abertura correta de tubos de ensaio com rolhas de algodão;
Abertura de placas de Petri;
Flambagem da boca de tubos e frascos estéreis
Executar semeadura em meio líquido;
Executar a semeadura em meio sólido pela técnica do esgotamento;
Descrever as características morfológicas de uma colônia.
USO DO BICO DE BUNSEN NO LABORATÓRIO DE BACTERIOLOGIA:
O bico de Bunsen é freqüentemente utilizado nos laboratórios de bacteriologia para evitar a contaminação do manipulador, do material esterilizado ou de culturas de microrganismos. Com poucas exceções devemos empregar técnicas assépticas durante o trabalho em bacteriologia, a fim de evitar a penetração ce um microrganismo num local que não o contenha.
ZONA DE SEGURANÇA DO BICO DE BUNSEN
A zona de segurança do bico de Bunsen corresponde a uma região de aproximadamente 10 cm de raio em torno do bico de Bunsen, onde o ar aquecido tende a formar uma corrente no sentido de baixo para cima, evitando que microrganismos que estejam em suspensão no ar penetrem e contaminem esta área. È somente nesta zona que os tubos ou os recipientes com meios de cultura estéreis ou com material a ser inoculado, deverão ser abertos ou manipulados. Qualquer outro material deverá ser mentido nesta área, para ser preservada sua esterilidade. As manipulações devem ser feitas, preferencialmente, por trás da chama do bico de Bunsen.
ALÇAS E AGULHA BACTERIOLÓGICAS
As alças e agulhas bacteriológicas são feitas de fio de platina (ou níquel-cromo), de calibre 24 a 26, fixados a um suporte. Nas alças, o fio de platina é fechado na extremidade em forma circular, com um diâmetro de 2 a 3 mm. Os fios de níquel-cromo, de custo menor, são adequados para certos tipos de trabalhos, apresentando as vantagens de aquecimento e resfriamento rápidos.
Para a esterilização de alças e agulhas bacteriológicas as mesmas devem ser deixadas em contato com a chama esterilizante até o ponto de incandescência (até ficarem rubras). Durante a flambagem estes materiais devem ser mantidos em posição vertical à chama do bico se Bunsen, movendo-se rapidamente o suporte da alça para dentro da chama, de maneira que alguns centímetros do suporte também sejam flambados ligeiramente. Recomenda-se esterilizar o material sempre no sentido do cabo para a extremidade da alça ou agulha e deixa-lo esfriar em seguida na zona de segurança do bico de Bunsen.
TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO
Serão realizadas as seguintes técnicas de inoculação:
Cultura ð Meio líquido (caldo simples)
Meio líquido
ò ø Meio sólido (ágar inclinado)
Meio sólido em placa
ATENÇÃO!!!!
As seguintes normas devem ser seguidas nas inoculações dos meios de cultura:
q O fio e a alça de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer inoculação, ou seja, devem ser aquecidos ao rubro na chama esterilizante. Para a coleta do inoculo, devem ser chama esterilizante. Para a coleta do inoculo, devem ser esfriados na parte interna do recipiente com o meio de cultura; os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc.) com meio de cultura sempre ser abertos próximo ao bico de Bunsen;
q A boca dos tubos de ensaio deve ser aquecida depois de retirada e antes da colocação da tampa. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão direita durante a inoculação;
q Evitar introduzir a alça quente dentro da amostra, porque isso pode causar a contaminação do ambiente pela formação de aerossóis e a morte dos microrganismos que se encontram na amostra devido ao intenso calor desprendido pela alça.
A)TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO LÍQUIDO:
q Flambar a alça e deixar esfriar;
q Retirar a tampa (de rosca ou tampão de algodão) do tubo e retirar com a lça uma porção de amostra;
q Fechar o tubo que contém a amostra;
q Retirar a tampa do tubo que vai ser inoculado
q Introduzir a alça até aproximadamente ¼ de profundidade do meio;
q Fechar o tubo.
B) TÉCNICA DE SEMEADURA EM MEIO SÓLIDO EM TUBO (ÁGAR INCLINADO):
q Flambar a alça e deixar esfriar;
q Retirar a tampa (de rosca ou tampão de algodão) do tubo e retirar com a alça uma porção de amostra;
q Repor a tampa no tubo que contém a amostra;
q Retirar a tampa do tubo que vai ser inoculado;
q Introduzir a alça até a base da superfície do meio inclinado, passando-a ao longo da sua superfície em movimentos de zig-zag;
q Fechar o tubo.
C) TÉCNICA DE SEMEADURA DE MEIO SÓLIDO EM PLACA (ESGOTAMENTO):
Esta técnica é usada fundamentalmente para se obter (isolar) culturas puras de amostras que contenham microbiota mista, sendo igualmente útil para o estudo da morfologia colonial. A superfície do ágar nas placas deve ser lisa e úmida, porém sem umidade excessiva, uma vez que isso poderia ocasionar um crescimento confluente.
A técnica de esgotamento em placa consiste em depositar sobre um ponto da superfície do meio uma alíquota do material e depois espalha-lo em dois ou três setores, com o auxílio de alça bacteriológica, sem recarregá-la, de modo a obter quantidades progressivamente menores do material, e assim formando colônias perfeitamente isoladas.
O sucesso da semeadura está em:
ü Grande número de estrias
ü Não perfurar o meio
ü Não voltar a alça pela parte já estriada
ü Pegar pequena quantidade de material para semear.
UNIDADE 2: Meios de cultura para bactérias
Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial (in vitro) dos microrganismos. Estes meios fornecem princípios nutritivos indispensáveis ao seu crescimento. Qualquer meio de cultura deverá sempre apresentar: uma fonte de carbono orgânico, uma fonte de nitrogênio orgânico, sais minerais, vitaminas, água, tensão osmótica adequada e pH adequado.
Podemos classificar os meios de cultura em diversos tipos de acordo com a:
1 – Composição química
- Sintéticos: são meios quimicamente definidos
- Complexos: são quimicamente indefinidos; constituídos por substâncias provenientes da natureza
2 – Função
- Enriquecidos: são meios sólidos ou líquidos, adicionados de um ou mais constituintes para permitir o crescimento de bactérias mais exigentes (ex.: Ágar Sangue).
- Enriquecimento: são meios líquidos que inibem o crescimento de certas espécies bacterianas e estimulam o crescimento de outras.
- Seletivo-indicador: são meios sólidos que inibem o desenvolvimento de certas espécies bacterianas e permitem o desenvolvimento de outras, dando informações sobre as espécies que estão sendo cultivadas (ex.: Ágar Manitol Salgado, Ágar E.M.B).
- Manutenção: são meios empregados para a estocagem de culturas em laboratório, uma vez que mantém as características fisiológicas e a viabilidade das bactérias durante longo tempo (ex.: Ágar Nutriente, Meio de Glicerol, meios semi-sólidos para estocagem).
- Meio de identificação: são meios que possuem substâncias que evidenciam uma característica que permita separar um grupo ou uma espécie de microrganismo.
3- Consistência
- Sólidos: contém 1,5 a 3,0% de ágar
- Semi-sólidos: contém 0,5 a 1,0% de ágar
- Líquidos: contém até 0,1% de ágar
Fontes:
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